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Transwell實驗技術(shù)

更新時間:2022-05-19      點擊次數(shù):2265

微孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)(Transwell 實驗):應(yīng)用微孔濾膜培養(yǎng)小室,進(jìn)行膠質(zhì)瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng),可以更接近體內(nèi)環(huán)境,模擬瘤細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用,濾膜上8μm的微孔可允許內(nèi)皮細(xì)胞穿過到達(dá)膜的下面,這些穿越遷移的內(nèi)皮細(xì)胞可粘附于膜的下面,通過計數(shù)濾膜下面的細(xì)胞可基本反映細(xì)胞的遷移情況。Transwell的基本原理是將Transwell小室放入培養(yǎng)板中,小室內(nèi)稱為上室,培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室,上室內(nèi)添加上層培養(yǎng)液,下室內(nèi)添加下層培養(yǎng)液,上下層培養(yǎng)液以膜相隔。將細(xì)胞種在上室內(nèi),由于膜有通透性,下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞,從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細(xì)胞生長、運(yùn)動等的影。選擇不同材料的膜和孔徑,可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。

(一)實驗材料及試劑

24孔培養(yǎng)板、Transwell小室、倒置顯微鏡、酒精燈、移液槍、CO2培養(yǎng)箱、細(xì)胞計數(shù)板等;血清、低血清DMEM培養(yǎng)液、多聚甲醛、結(jié)晶紫、PBS等。

(二)實驗內(nèi)容

1、分別取實驗分組的細(xì)胞種板前1天,血清饑餓12小時,常規(guī)消化、離心收集細(xì)胞,用低血清DMEM培養(yǎng)液(含0.2% FBS)混懸成密度為5×105/ml的單細(xì)胞懸液。

2、將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中,上室內(nèi)加入100 μl細(xì)胞懸液(約5×104細(xì)胞),下室內(nèi)加入500 μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液。

3、置于5% CO2,37℃孵箱培養(yǎng)24小時后,PBS洗2次,用棉球小心擦去上室內(nèi)細(xì)胞,4%多聚甲醛固定20~30 min,PBS洗2次,0.1 %結(jié)晶紫染色30 min,PBS洗2次,去掉多余染料,顯微鏡下觀察拍照。

(三)注意事項

Transwell小室可重復(fù)利用多次,但在棉簽擦拭的時候力度避免過大,以免損傷小室膜;重復(fù)使用之前可觀察小室膜是否出現(xiàn)裂痕,若出現(xiàn)較多裂痕可停止使用。


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