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細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)

更新時間:2022-05-19      點擊次數(shù):1562

一、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

 細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA,RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩大類。本實驗室主要是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染miRcroRNA轉(zhuǎn)染、慢病毒轉(zhuǎn)染藥物轉(zhuǎn)染、多肽轉(zhuǎn)染等。

二、miRcroRNA轉(zhuǎn)染

(一)實驗材料及試劑

        六孔板、CO2培養(yǎng)箱、EP管、酒精燈等;無血清培養(yǎng)基、MEM-α或DMEM、RNA、lipofectamine 2000、MSC細(xì)胞等。

(二)實驗內(nèi)容

1當(dāng)六孔板中MSC細(xì)胞密度達(dá)90%時,準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染,將無血清培養(yǎng)基、MEM-α或DMEM取出復(fù)溫并注意平衡好;

2取出細(xì)胞,將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基,放回孵箱培養(yǎng);

3取滅菌的EP管,按要求混好RNA(約100pmol/孔),每管250ul DMEM,混勻;

4另取EP管,加入lipofectamine 2000(5 ul/孔)和MEM-α或DMEM(250ul/孔),輕輕混勻后室溫靜置5min;

5將上述兩個EP管混勻;

6室溫靜置20min,將lipofectamine 2000-質(zhì)?;旌弦旱蔚搅装逯校?00ul/孔;

7將細(xì)胞放回孵箱培養(yǎng),4h后換回含血清的*培養(yǎng)基。

(三)注意事項

1轉(zhuǎn)染的時候培養(yǎng)基中不能添加抗生素。抗生素,比如青霉素和鏈霉素,一般對于真核細(xì)胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素。

2如果在無血清條件下轉(zhuǎn)染,使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長培養(yǎng)基,替換為0.5mL無血清培養(yǎng)基。

3在37℃,5%的CO2中保溫24-48小時,無須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在4-5小時后更換生長培養(yǎng)基也不會降低轉(zhuǎn)染活性。


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